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    內(nèi)參GAPDH有兩條帶能用嗎(內(nèi)參兩個條帶)

    發(fā)布時間:2023-04-13 20:15:41     稿源: 創(chuàng)意嶺    閱讀: 50        

    大家好!今天讓創(chuàng)意嶺的小編來大家介紹下關于內(nèi)參GAPDH有兩條帶能用嗎的問題,以下是小編對此問題的歸納整理,讓我們一起來看看吧。

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    本文目錄:

    內(nèi)參GAPDH有兩條帶能用嗎(內(nèi)參兩個條帶)

    一、做定量pcr時內(nèi)參GAPDH變化了,是不是要換個內(nèi)參?

    可以換一個。其實很多藥物影響糖代謝,會改變GAPDH。建議試試PPIA(肽基脯氨酸異構(gòu)酶),它與蛋白質(zhì)表達有關,含量比較穩(wěn)定,除靜息細胞外基本不變。

    二、哪位知道GAPDH內(nèi)參有什么優(yōu)點?

    ◆Real-time PCR技術的原理就是用一種標準對照能夠估計出一種特異性靶DNA或RNA分子的相對含量。

    ◆這種標準對照就是參照物,在定量PCR中,用它來作為擴增系統(tǒng)的陽性對照,并作為未知樣品定量的標準,同時通過競爭性作用校正擴增系統(tǒng)內(nèi)管間的擴增效率,使其具有可比性。參照物按其性質(zhì)不同可分為內(nèi)參照和外參照。內(nèi)參照是與目的基因加于同一反應管中,與目的基因同時進行擴增,以反映體系中可能出現(xiàn)的PCR影響因素,此即所謂的競爭性PCR;而外參照則是參照物與目的基因的擴增分別在不同的管間進行,此即所謂的非競爭性PCR。

    ◆搞清了內(nèi)參和外參的概念,你的問題也就很容易解答了:由于你實驗中GAPDH和目的基因反應體系是在不同的EP管中進行,所以它應屬于外參照。

    三、內(nèi)參配制方法

    內(nèi)參配制方法:WB操作簡單,既可以定性分析表達產(chǎn)物,同時還可以指示目的蛋白量的相對變化。作為一種有活性的生物大分子,抗體和抗原的反應是比較復雜的,因此用來測定表達產(chǎn)物時存在著一定的不確定性。所以,在WB實驗設計中加入良好的參照體系,對實驗結(jié)果分析是非常有幫助的。 參照體系通常包括分子量Marker(用來確定蛋白條帶對應的分子量大小),空白載體對照(如果是誘導表達體系還應該有誘導前的對照),已知量標準產(chǎn)物的正對照,此外還有內(nèi)參。

    內(nèi)參是zui容易被忽略的一項,如果要用WB比較不同條件下或者不同組織中,目的蛋白表達量的相對多少,等量的細胞上樣才有比較的基礎。特別表達量不高時,上樣量的差別就很可能影響結(jié)果的分析,所以此時內(nèi)參就顯得尤為重要。

    內(nèi)參即是內(nèi)部參照(Internal Control),對于哺乳動物細胞表達來說一般是指由管家基因編碼表達的蛋白(Housekeeping Proteins),它們在各組織和細胞中的表達相對恒定,在檢測蛋白的表達水平變化時常用它來做參照物。在WB實驗中,除了需要進行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上樣電泳、轉(zhuǎn)膜、靶蛋白抗體孵育、顯色等步驟以外,還需要進行內(nèi)參的檢測,以校正蛋白質(zhì)定量、上樣過程中存在的實驗誤差,保證實驗結(jié)果的準確性。

    蛋白濃度測定是比較各種樣品間上樣量的*方法。然而各種蛋白質(zhì)濃度定量方法都存在局限性,不能*準確的確定各種樣品的準確蛋白濃度。如UV法直接定量,適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì),相對于比色法來說,操作簡單,但是容易受到平行物質(zhì)的干擾,如DNA的干擾;且敏感度低,要求蛋白的濃度較高。比色法測定蛋白濃度一般有BCA,Bradford,Lowry 等幾種方法。BCA法與Lowry法都容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。Bradford 法敏感度zui高,且與一系列干擾Lowry,BCA 反應的還原劑(如DTT,巰基乙醇)相容。但是對于去污劑依然是敏感的,其zui主要的缺點是不同的標準品會導致同一樣品的結(jié)果差異較大,無可比性。另外,蛋白質(zhì)定量以后進行電泳時需要等量上樣,此步驟也存在操作誤差。在WB實驗時使用內(nèi)參,即可簡便地對定量和上樣步驟產(chǎn)生的誤差進行校正。

    在WB中使用內(nèi)參其實就是在WB過程中的另外用內(nèi)參對應的抗體檢測內(nèi)參,這樣在檢測目的產(chǎn)物的同時可以檢測內(nèi)參的表達,由于內(nèi)參在各組織和細胞中的表達相對恒定,借助檢測每個樣品內(nèi)參的量就可以用于校正上樣誤差,這樣半定量的結(jié)果才更為可信。此外使用內(nèi)參可以作為空白對照,檢測蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否*、整個WB顯色或者發(fā)光體系是否正常。

    實驗結(jié)果分析其實很簡單:如果樣品蛋白量有限,只夠進行一次電泳轉(zhuǎn)膜實驗時,分別檢測樣品的內(nèi)參量和目的蛋白量。將各樣品目的蛋白量分別除以其內(nèi)參含量,得到的數(shù)值即為內(nèi)參校正后的各樣品中目的蛋白相對含量,再用此數(shù)值進行樣品間的比較和分析,得到目的蛋白含量在不同樣品間的實際變化結(jié)果。如果樣品量充分,可以先檢測內(nèi)參,觀測樣品間內(nèi)參顯色條帶是否一致,根據(jù)差異大小調(diào)整各樣品的上樣量重新進行Western Blotting實驗,至內(nèi)參量一致為止;若內(nèi)參一致,即可進行不同樣品間目的蛋白表達變化分析。常用的蛋白質(zhì)內(nèi)參有GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)和細胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。

    四、gapdh什么情況下不用做內(nèi)參

    不恒定。GAPDH的基因表達量在是不同狀態(tài)下是變化很小的,所以可以認為GAPDH表達是恒定的,能夠可以選擇它來做內(nèi)參,只有不恒定的情況下才不會選擇做,這樣會導致GAPDH的表達量會增多。

    以上就是關于內(nèi)參GAPDH有兩條帶能用嗎相關問題的回答。希望能幫到你,如有更多相關問題,您也可以聯(lián)系我們的客服進行咨詢,客服也會為您講解更多精彩的知識和內(nèi)容。


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